Полимеразно-цепная реакция (ПЦР)

• Принцип действия анализа ПЦР
• Как проводят анализ ПЦР
• Какова точность ПЦР
• Всегда ли можно ориентироваться только на результаты ПЦР

Полимеразно-цепная реакция, или ПЦР, это революционный метод молекулярной биологии, который впервые был применен в 80 годах прошлого века. Суть метода ПЦР состоит в том, что благодаря этому анализу стало возможным обнаруживать различные бактерии и вирусы очень быстро, путем определения их фрагментов в материале от больного.

Принцип действия анализа ПЦР

Принцип действия ПЦР состоит в многократном синтезе копий генетического материала вирусов или бактерий в лабораторных условиях. Для понимания этого явления напомним, что основой хранения наследственной информации и основой жизни является ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота. ДНК состоит из двух нитей, которые сформированы из азотистых оснований – нуклеотидов. Нуклеотидов всего четыре. Нуклеотиды обладаютс свойством комплементарности, то есть с определенным типом нуклеотида может связаться только определенный тип другого нуклеотида. Например известны нуклеотиды аденин, тимидин, цитозин и гуанин. Из них аденин может связываться с тимидином, а цитозин с гуанином. Но не наоборот. В последовательности нуклеотидов закодирована уникальная для каждого живого организма информация. Будь то человек или вирус. У некоторых вирусов наследственная информация закодирована в другой нуклеиновой кислоте –РНК. Как ДНК, так и РНК являются уникальными для каждого живого организма. Поэтому, идентифицировав ДНК, можно с уверенностью утверждать, что она принадлежит определенному микроорганизму. Упрощенно такой механиз идентификации можнро сравнить с отпечатками пальцев. Рисунок линий на пальцах уникален для каждого человека. Нет необходимости видеть портрет. Достаточно просто сверить отпечаток пальца с базой данных. Таким же образом работает и ПЦР. В роли «отпечатка пальца» при диагностике бактериальных или вирусных заболеваний выступает фрагмент ДНК или РНК. Выделив ДНК возбудителя от больного, можно совершенно четко его идентифицировать. Таким образом метод ПЦР основан на идентификации возбудителя по его ДНК или РНК. При этом даже не важно, живой возбудитель или уже нежизнеспособный. Метод ПЦР с одинаковым успехом, в отличие от бактериологического посева, может идентифицировать присутствие возбудителя.

Чувствительность метода ПЦР настлько высока, что теоретически можно обнаружить бактерию или вирус, даже если они находятся в образце в количестве 1 единицы.

Как проводят анализ ПЦР

Прежде всего для ПЦР осуществляют забор материала. Материал от пациента помещают в специальные пробирки. Материалом может служить кровь, слюна, клетки эпителия, отделяемое из мочеиспускательного канала, шейки матки или влагалища.

Затем образец доставляют в лабораторию, где происходит собственно сам процесс ПЦР. Суть ПЦР заключается в синтезе огромного количества копий фрагмента ДНК или РНК возбудителя. Большое количество генетического материала необходимо для идентификации ДНК. Для того, чтобы запустить реакцию, вначале проводят денатурацию ДНК: две нити разделяют путем нагревания. Затем к денатурированной ДНК добавляют праймер и фермент ДНК-полимеразу. Праймер служит начальной точкой для сборки новой цепочки ДНК, а ДНК-полимераза собственно этот процесс и обеспечивает. Вновь синтезированная ДНК будет полоностью идентична первоначальной. Затем опять проводят денатурацию и опять повторяют синтез ДНК. Так продолжается в течение 2 часов. За это время получают миллионы вновь синтезированных копий. Естественно, что огромное количество копий легче идентифицировать чем один-единственный фрагмент. По количеству синтезированных копий делают расчет количества первоначального числа возбудителя в образце. Идентифицируют возбудителя на третьем этапе ПЦР. При помощи электрофореза в геле. Этот процесс идет несколько часов. Поэтому длится анализ ПЦР обычно около суток. Существует также возможность оценивать количество и идентифицировать ДНК возбудителя непосредственно во время синтеза новых копий. Эти реакции называются ПЦР в реальном времени.

Какова точность ПЦР

Метод ПЦР очень точный. Благодаря тому, что при этом анализе идет идентификация уникальных структур для каждой бактерии и вируса. Методика ПЦР признана золотым стандартом для диагностики многих вирусных и бактериальных инфекций. Чувствительность методики также очень высока. ПЦР может идентифицировать возбудителя даже в том случае, когда другие методы диагностики еще ничего не показывают. Настоящей революцией можно назвать применение ПЦР в диагностике вирусных заболеваний. Важное преимущество ПЦР перед исследованиями крови на антитела состоит в том, что для синтеза антител во время инфекции требуется определенное время, а при помощи полимеразно-цепной реакции можно идентифицировать возбудителя сразу, как только он появляется в организме. В нашей практике ПЦР широко применяется для диагностики трихомониаза, микоплазмоза, уреаплазмоза, хламидиоза, ВПЧ и других ЗППП.

Точность ПЦР зависит от праймера. Если праймеры некачественные, это может привести к недостаточной чувствительности метода. Исходя из самой специфики полимеразно-цепной реакции к лабораториям, где проводятся эти анализы, предъявляются очень жесткие требования по соблюдению чистоты помещения. Дело в том, что случайно попавший фрагмент ДНК из другого анализа, может привести к ложноположительному результату. Для того, чтобы этого не было, в лабораториях используются разные помещения для разных этапов анализа и осуществляется специальная вентиляция со строго определенным движением воздуха.

Всегда ли можно ориентироваться только на результаты ПЦР

При проведении ПЦР происходит идентификация возбудителя независимо от того, жизнеспособен ли он или неактивен. Проверить это невозможно, так как ДНК присутствует и в мертвых клетках. В качестве примера можно привести идентификацию личностей при авиакатастрофах, где также используется ПЦР. В клинической практике же вопрос активности возбудителя очень актуален, так как необходимы четкие критерии по которым решается вопрос о прекращении лечения или о продолжении. Если возникает ситуация, что анализ ПЦР положительный, а пациент уже прошел лечение, необходимо делать другие анализы. В тех случаях, когда это возможно – бакпосев. Если невозможно осуществить выращивание возбудителя на искусственных питательных средах, делают анализы на уровень иммуноглобулинов к данном возбудителю.

В нашей клинике специалисты используют все методы диагностики, которые необходимы именно данном пациенту в определенной ситуации. Доскональное знание методик диагностики позволяет назначать именно необходимые анализы, которые не сильно отражаются на бюджете пациента.